實(shí)驗(yàn)原理

　　細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196~C液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。 細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

　　目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

　　實(shí)驗(yàn)材料

　　儀器：MVE液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等

　　試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液)

　　附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)5-20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

　　2.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

　　3.沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。

　　4.將懸液分至凍存管中，每管1ml。

　　5.將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。

　　6.貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

　　7.按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時(shí))→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

　　注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，絕對(duì)不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。MVE液氮罐